15世纪晚期的意大利政治版图基本上被大大小小的新君主国主宰。在君主的宫廷，对文学和艺术的赞助既是君主美德的体现，也是奢华和优雅的宫廷生活必不可少的点缀。在佛罗伦萨共和国，其实际统治者洛伦佐·德·美第奇不仅大力赞助文学艺术，而且利用“艺术外交”打造宫廷间的政治联盟，提高个人的国际声望。将佛罗伦萨的艺术品和艺术家作为“礼物”赠给其他国家是其“艺术外交”的主要内容。1481年，达·芬奇奉洛伦佐之命前往米兰为卢多维科·斯福尔扎公爵效劳。卢多维科的宫廷聚集着一批杰出的历史学家、诗人、艺术家和科学家，安布罗斯修道院图书馆和米兰附近的帕维亚大学也是重要的科学文化中心，这些均深刻影响了达·芬奇在科学方面的研究。

　　达·芬奇在给卢多维科的自荐信中列数了自己的十多项才能，包括军事工程、武器设计以及建筑、雕塑和绘画等。1489年，达·芬奇正式进入宫廷，直到1499年。其间，他为卢多维科的情人画肖像（即《抱银鼠的女子》和《美丽的费隆妮叶夫人》），并在感恩圣马利亚教堂的食堂绘制了著名壁画《最后的晚餐》（1495-1498年），还作为建筑顾问参与了城市规划和米兰主教堂圆顶设计。在此过程中，受古罗马建筑师维特鲁威的建筑理论的启发，他开始探索人体比例与建筑和整个宇宙的关系，著名的《维特鲁威人》由此诞生。其中，一个四肢伸展站立的裸体男子与一个正方形和圆完美内接。此外，他还制作了卢多维科父亲的青铜骑马像模型、组织了多场盛大的宫廷庆典并为其设计道具、服装和机械装置。

　　多样的艺术工作使达·芬奇的视野不断拓展。除了艺术，他开始深入研究数学、光学、解剖学和工程学等领域。他主要靠实践获得知识，也从宫廷学者和帕维亚大学的教授那里获得帮助。此外，他还尽力购买或借阅相关书籍来丰富自己的理论知识。得益于100多年来人文主义者对古代手稿的搜集以及活字印刷术的发明，达·芬奇阅读了许多重要的文学、军事和科学著作。1494年，法国军队入侵，意大利再次陷入战争的泥潭。为铸造青铜骑马像准备的70吨青铜熔铸成了大炮，达·芬奇制作的黏土模型也被法国士兵毁掉。1499年，法国人卷土重来并占领米兰，卢多维科被囚。达·芬奇被迫离开米兰，在曼托瓦和威尼斯短暂逗留后，于1500年回到佛罗伦萨。